一.线粒体部分

1.1 线粒体全基因组

1.1.1 单倍型网络

使用MAFFT v7.427软件（--auto模式）对115个（10415的100个+3280的15个）样品序列进行比对，
使用DnaSP v6（http://www.ub.edu/dnasp/） 载入比对结果并结合样品分组生成单倍型的nex文件，
使用PopART v1.7（https://popart.maths.otago.ac.nz/download/） 载入nex文件后绘制单倍型网络图。

1.1.2 单倍型序列构建进化树

上一步共鉴定出83个单倍型。
采用83个单倍型序列做进化树分析，物种间序列用MAFFT v7.427软件（--auto模式）进行多序列比对。
在贝叶斯信息准则下，使用jModelTest v2.1.10寻找最优的核苷酸替代模型。
使用raxml-ng v1.2.2（https://github.com/amkozlov/raxml-ng） 软件，
选用GTR模型，1000次bootstrap重复分析，构建最大似然进化树。

1.2 线粒体共有cds构建进化树

从116个（3280的15个+10415的100个+7377的1个）gbk文件中提取13个蛋白编码基因并按基因名分组。
将每组CDS序列用MAFFT v7.427软件（--auto模式）进行多序列比对，
随后将比对好的CDS序列首尾相接（每个物种的CDS序列串联在一起）。
在贝叶斯信息准则下，使用jModelTest v2.1.10寻找最优的核苷酸替代模型。
最后用RAxML v8.2.10（https://cme.h-its.org/exelixis/software.html） 软件，选用GTR+I模型，rapid Bootstrap分析，bootstrap=1000，构建最大似然进化树。

二.核基因组部分

2.0 重测序分析部分

1.使用BWA v0.7.17对101个（10415的100个+7377的1个）样品测序数据与参考基因组进行比对。
2.变异检测过程如下：
(1) 对于BWA v0.7.17比对得到的结果，使用picard v2.21.2的Mark Duplicate工具去除重复，屏蔽PCR duplication的影响。
(2) 使用gatk v4.1.4.1进行InDel Realignment，即对存在插入缺失比对结果附近的位点进行局部重新比对(Local Realignment)，校正由于插入缺失引起的比对结果错误。
(3)使用gatk v4.1.4.1进行碱基质量值再校准（Base Recalibration），对碱基的质量值进行校正。
(4)使用gatk v4.1.4.1进行变异检测（variant calling），主要包括SNP和InDel。
(5)使用gatk v4.1.4.1对得到的变异结果进行校正，选取可靠的变异结果。
获得初步的vcf文件。

2.1 28s进化树

使用bcftools v1.9 从检测到的snp（上述初步的vcf文件）中提取28s区间的snp，共126个位点用于后续建树分析。
使用vcf2phylip v2.0（https://github.com/edgardomortiz/vcf2phylip) 将snp位点转换为fasta格式的序列比对文件。
使用FastTreeMP v2.1.11（https://morgannprice.github.io/fasttree） 选用gtr模型来快速构建28s进化树。

2.2 核基因组进化树

为了减少后续分析数据量，使用vcftools v0.1.16对检测到的snp（上述初步的vcf文件）进行过滤，获取可信的变异位点，过滤标准如下：
(1) --minDP 30 变异位点深度大于30X；
(2) --max-missing 0.9 变异位点信息完整度≥90%；
(3) --minQ 50 变异位点质量值大于50；
(4) --minGQ 20 样本基因型质量大于20；
(5) --maf 0.05 次要等位基因频率（MAF）大于5%；
(6) --min-alleles 2 --max-alleles 2 仅保留双等位基因位点。
最后得到2561个位点用于后续建树分析。
使用vcf2phylip v2.0（https://github.com/edgardomortiz/vcf2phylip) 将snp位点转换为fasta格式的序列比对文件。
使用FastTreeMP v2.1.11（https://morgannprice.github.io/fasttree） 选用gtr模型来快速构建核基因组进化树。